论文发表

恶性脑胶质瘤U87细胞系肿瘤干细胞放疗

敏感性的体外实验研究

赵红宇1，徐  东1，李  帅1，王  倩2，刘海君3，金  辉4，刘云会1*中国医科大学附属盛京医院神经外科赵红宇

（1 中国医科大学盛京医院神经外科，沈阳110004；2 中国医科大学93期；3 中国医科大学93期七年制；4 中国医科大学临床药理实验室）

摘要：目的  探讨脑胶质瘤细胞系U87细胞及其肿瘤干细胞（CSCs）对体外放疗的敏感性。方法  应用神经干细胞（NSCs）培养基分离培养形成细胞球克隆，检测细胞球细胞的NSCs特性。采用不同剂量放射线照射U87细胞及其CSCs，应用集落形成实验和生存曲线检测其生存情况。结果  U87细胞在NSCs培养基中形成悬浮的细胞球克隆，具有自我更新和多向分化能力，表达CD133、Nestin；两种细胞的存活率均随照射剂量增加而下降，且CSCs的存活率明显高于U87细胞（P<0.01）。 结论  在体外条件下，CSCs的放射敏感性明显低于U87细胞，其可能是恶性脑胶质瘤放疗抵抗的主要原因。

关键词：脑胶质瘤，恶性；U87细胞系；肿瘤干细胞；放疗敏感性

中图分类号：R  文献标志码：A  文章编号：1002-266X(2011)25

Research on radiosensitivity of malignant glioma U87 cell line cancer stem cells in vitro

ZHAO Hong-yu, XU Dong, LI Shuai, WANG Qian, LIU Hai-jun, JIN Hui, LIU Yun-hui

（1 Department of Neurosurgery, The Shengjing Hospital, China Medical University,Shenyang 110004, China）

Abstract：Objective  Investigate radiosensitivity of glioma cell line U 87 cells and cancer stem cells (CSCs) in vitro. Methods  U87 cell was cultured in neural stem cells medium (NSCs-medium), NSCs-medium was used to isolate spheres from primary cultured tumor cells derived from U87 cell line, and was identified as CSCs U87 cells. CSCs were irradiated by X-rays with different doses, respectively. Colony-forming experiment was used to detect cell survival, and survival curves were drafted, respectively.  Results  U87 cells formed suspension in serum-

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30700861）；辽宁省教育厅科研项目计划（L2010601）。

*通讯作者

free stem cell medium and proliferated into the clonal sphere.The clonal spheres presented strong self-renewal and multipotency ability, and expressed specific marker CD133, Nestin. The cell survival curves showed that the survival rates decreased along with increased irradiation doses, and the ratios of cell clone formation in CSCs subpopulation was higher than in U87 cell significantly（p<0.01）. Conclusion  Radiosensitivity of CSCs is strikingly lower than that of U87 cells in vitro, which may be the culprit of malignant glioma radioresistance.

Key words： Glioma; Malignant; U87 cell line; cancer stem cells;Radiosensitivity

恶性脑胶质瘤是最常见的恶性程度最高的中枢神经系统肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的60%以上，虽经放疗、化疗及手术治疗等多种治疗手段的干预，但死亡率仍一直居高不下，恶性胶质瘤患者的中位生存期仅为14.6个月，成为困扰神经外科医生的一个难题[1]。近来研究表明，在胶质瘤内部，存在着一个小的细胞亚群-肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），它们具有干细胞的特性，能够进行自我更新、多向分化及体内致瘤，是肿瘤发生、发展的根源[2]。在脑胶质瘤CSCs成功分离与鉴定的基础上，不断有学者提出CSCs的治疗策略[3]。2007～2008年，我们在成功分离、鉴定U87恶性胶质瘤CSCs的基础上，检测了脑胶质瘤细胞系U87细胞及其CSCs的体外放疗敏感性，旨在探讨CSCs在恶性胶质瘤放疗抵抗性中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1. 1  材料  脑胶质瘤细胞系U87细胞（中国科学院），DMEM/F12培养液 (Invitrogen 公司), 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (GIBCO 公司)。NSCs标记物鉴定试剂盒(NSCs marker characterization kit, Chemicon公司)包括：小鼠抗人CD133单抗,小鼠抗人Nestin单抗，小鼠抗人微管相关蛋白2（MAP2）单抗，兔抗人胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）多抗，小鼠抗人O1单抗。Cy3标记的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(Chemicon公司)。

1.2  实验方法

1.2.1  U87细胞的培养和传代  U87细胞接种于含 10%胎牛血清的 DMEM / F12 培养基中 ,在37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。5～7 d后，按 1∶2或 1∶3的比例传代。

1.2.2  CSCs的培养和传代  U87细胞接种于含B27（20µg/ml）、肝素( 5mg/ml)、EGF (20ng/m l)和 bFGF (20ng/m l)的无血清DMEM / F12培养液中 ,在 37℃、5%CO2 的饱和湿度培养箱中培养。待U87细胞增殖形成细胞球3、4d后 ,吸取上清液体培养液 (含细胞球 )重新吹打成单细胞悬液 ,按1∶2或1∶3的比例传代。

1.2.3  CSCs的鉴定  原代细胞球形成并达到100~200个细胞之后，收集这些细胞球，应用0.1%胰蛋白酶 (trypsin) 和1×EDTA在37℃下处理10min，细胞球被分解成为单细胞并转移到96孔培养皿进行培养，稀释细胞悬液达到1~2个细胞/孔，观察单细胞克隆能力。将细胞离心后种植于预涂渍的盒式载玻片中，以2%多聚甲醛固定，室温下15min；10%驴血清封闭，室温下1h。以NSCs标记物鉴定试剂盒进行细胞染色，室温孵育2h；加入Cy3标记的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗 (1:250)，室温孵育1h。荧光显微镜下随机选择20个高倍视野进行阳性细胞计数。

1.2.4  实验分组及照射干预  两种细胞均各自以随机数字法设立对照组及照射组，对照组不进行照射，照射组进一步分为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy剂量组。均在室温下用西门子Primus-M型直线加速器进行照射。

1.2.5  集落形成实验  分别收集两种细胞制成悬液，加入24孔培养皿中，每平皿接种400个细胞，对照组及照射组细胞均在37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养7d后，用95%乙醇固定，0.25%结晶紫染色，并计数>50个细胞的集落，计算集落形成率及细胞存活分数（SF，SF=照射组集落形成率/对照组集落形成率）.

1.3  统计学方法  采用SPSS13.0统计软件，组间率的比较用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  U87细胞的生长及CSCs的形成与增殖  在FBS的DMEM/F12培养基中，U87 细胞呈贴壁生长并交织成网状。将在含10%FBS的DMEM/F12培养基中单层贴壁生长的细胞，转移到无血清的干细胞培养基中培养5~7天后，一小部分细胞自我增殖成呈球状或卵球状悬浮的细胞球克隆，每球约有100~200个细胞。初代的细胞球细胞分解成单细胞后，重新在干细胞培养液中培养，细胞均能形成2代细胞球。

2.2  CSCs的鉴定  细胞球细胞表达NSCs的表面标记物CD133、Nestin，而不表达星形细胞标记物GFAP和神经元标记物MAP2，极少表达少突胶质细胞标记物O1。大部分分化细胞表达GFAP，少数细胞表达MAP2 和O1。

2.3  X线照射对U87 细胞及CSCs的影响作用比较  照射组照射0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0Gy剂量时，U87细胞及CSCs的存活率分别由1%逐渐降至0、0.2%。随着照射剂量增加，U87细胞及CSCs的存活率均下降。且CSCs的存活率高于U87细胞（P<0.01）。

3  讨论

近年研究表明[4,5]，恶性脑胶质瘤内具有NSCs特性的细胞亚群CSCs，在肿瘤发生、发展中发挥了决定性作用。这些细胞在体外可形成克隆球，具有多向分化及体内致瘤能力。本研究结果显示，恶性脑胶质瘤细胞系U87细胞及CSCs接受X线照射后，其细胞存活率均下降，且随着放射剂量增加而细胞存活率下降；并发现在同一剂量放射线干预下，U87细胞的存活率明显低于CSCs。表明U87细胞系CSCs的放射敏感性明显低于U87细胞，CSCs具有明显的放疗抵抗性。

目前，应用传统的抗肿瘤放疗手段虽能抑制肿瘤细胞增殖，但其是作用短暂，且肿瘤容易复发。近年研究认为，因CSCs较其他分化的肿瘤细胞具有更强的放疗抵抗性，故放射线干预仅能杀灭或抑制肿瘤中的非肿瘤干细胞，而对其CSCs则较少或无治疗作用[6]。本研究结果证实了这一现象。

放射生物学理论认为，DNA作为放射线对细胞作用的关键靶点，在放疗机制中发挥重要的作用;DNA损伤程度可反映放疗敏感性的强弱，DNA损伤后迅速修复是放疗抵抗性的关键原因[7]。Bao等[8]研究发现，在放射剂量干预下，CSCs的相对比例增加CSCs的存活比例明显高于肿瘤细胞；并发现CSCs的放疗抵抗性增高是通过优先激活检查点蛋白实现的，应用检查点激酶（Chk1、Chk2）的特异性抑制剂能抑制CSCs的DNA损伤修复，逆转CSCs的放疗抵抗性。提示CSCs的放射敏感性可能与影响细胞周期调控及信号转导通路改变有密切关系。

综上所述，根据CSCs的放疗抵抗特性，寻找特异性针对CSCs的治疗手段，有可能从根本上遏制肿瘤生长；探索针对CSCs的放射增敏，将成为肿瘤放疗极具前途的发展方向。

参考文献:

[1] Stupp R, Mason W P, van den Bent M J, et al. Radiotherapy plus con2comitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med, 2005, 352 (10): 9872-9996.

[2] 苏进,许新华.肿瘤干细胞生物学特性及相关研究进展[J].肿瘤防治研究, 2010, 37(4): 474-476.

[3] 张胜平，黄金，邓兴力，等. 脑胶质瘤干细胞基因靶向治疗研究紧张[J].国际神经病学神经外科学杂志, 2010, 37(1): 25-28.

[4] 李明武,牛朝诗,董永飞,等.脑肿瘤干细胞的增殖活性与病理级别的相关性研究[J].中华神经外科疾病研究杂志, 2009, 8(6): 542-546.

[5] Ehtesham M, Mapara KY, Stevenson CB, et al. CXCR4 mediates the proliferation of glioblastoma progenitor cells[J]..Cancer Lett, 2009, 274(2): 305-312.

[6] Johannessen TC, Bjerkvig R, Tysnes BB. DNA repair and cancer stem-like cells --potential partners in glioma drug resistance[J].? Cancer Treat Rev, 2008, 34(6): 558-567.

[7] 谷铣之,殷蔚伯,余子豪,等.肿瘤放射治疗学[M].4版.北京:中国协和医科大学出版社, 2008:231-232.

[8] Bao S, Wu Q, McLendon RE, et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response[J]. Nature, 2006, 444(7120): 756-760.